이 영상물은 식품의약품안전평가원의 교육영상입니다.
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안전성약리 교육용 동영상-hERG assay
 
hERG assay(허그 에세이) 시험
이 동영상은 약물의 hERG channel current(허그 채널 커런트)에 대한 영향을 평가하는 실험으로 hERG channel이 영구적으로 발현되어있는 CHO(씨 에이치 오) 세포에서 허그전류를 측정하여 약물에 대한 영향을 평가하는 과정을 담은 것입니다
 
먼저, hERG channel(허그채널)이란 무엇인가?

초파리에 ether(에테르) 마취를 했을 경우 다리를 떨게 하는 유전자가 ‘eag'(에그) 즉, ether(에테르)-á(에이)-go(고)-go(고) gene (진)이라는 것인데 이 ’eag' 유전자와 49%정도 아미노기가 일치하는 사람에 존재하는 유사한 유전자를 hERG(허그), 즉 human eag-relate gene(휴먼 에그 리레이티드 진)입니다. 이 유전자가 발현이 되면 세포막 표면에 칼륨 채널(potassium channel)을 발현하게 되는데 이것이 hERG(허그) 채널입니다.
 
이 hERG 채널은 S1부터 S6까지 6개의 subdomain(서브도메인)하나의 domain(도메인)구성하고 있고, S5와 S6사이에 루프가 형성되어서 pore region (포어 리전)을 형성합니다. 그리고 4개의 domain이 다시 모여서 하나의 채널을 형성합니다.
 
이 hERG 채널의 전류는 심실의 활동전위의 재분극에 관여하게 되고 또한 심실의 활동전위는 심장의 심전도의 QT파에 관여하게 됩니다. 따라서 그림과 같이 hERG 채널 전류가 약물에 의해서 억제가 되면 심실의 활동전위의 간격이 늘어나게 되고 이는 심장의 심전도의 QT파를 늘어나게 합니다. 이를 QT prolongation(프로롱게이션)이라 합니다. 이런 현상이 지속되면 심장의 활동전위에 EAD가 발생하게 되고 리듬있게 박동하던 심장박동을 흐트러뜨리는 결과를 낳게 되어 심하게 되면 심부정맥을 유발해 급성돌연사를 유발할 수 있게 됩니다. 이러한 질환을 LQT syndrome(엘큐티 신드롬) 이라고 합니다.
 
자 이제hERG assay (허그 에세이)실험에 대해서 살펴보겠습니다.
 
hERG assay의 장비 구성은 그림과 같이 크게 앰프, 레코더 즉 소프트웨어, 그리고 AD converter(에이디 컨버터)로 구성되어있습니다.
 
1. Call control (셀 컨트럴)과정
먼저, 실험에 사용할 세포를 준비하는 것을 살펴보겠습니다. 액체질소탱크에서 얼려놓은 세포를 반출합니다.
 
미리37℃로 예열해 놓은 항온 수조에서 얼려있는 세포를 빠르게 녹입니다.
 
그리고, 미리 37℃, 5% CO2 incubator(씨오 투 인큐베이터)에 넣어놓은 배양액에 녹인 세포를 분주합니다. 그리고 incubator에서 2-3일동안 세포를 배양시킵니다. 세포는 접시의 바닥에 붙어서 자라게 됩니다.
 
세포가 자라면incubator에서 꺼내서 버리고 PBS로 washing(워싱)을 2번하고, trypsin(트립신)을 처리합니다.
 
Trypsin(트립신)이 처리된 세포를 CO2incubator(씨오투 인큐베이터)에서 1분간 두어서 세포를 접시의 바닥에서 떼어놓습니다.
 
그리고세포가 바닥에서 잘 떨어졌는지를 확인합니다.
 
떨어진 세포를 수거하여flask(플라스크)에 일부 넣고 다시 incubator(인큐베이터)에서 키우고 일부는 tube(튜브)에 담아놓고 실험에 사용합니다.
 
2. 용액준비
자 이제 실험에 사용될 용액을 만들어 봅시다. 용액은 크게 internal solution (인터널솔루션)과 external solution(익스터널 솔루션)인 Normal Tyrode solution(노멀 타이로드 솔루션)이 있습니다. 이는 용어대로 세포안쪽과 바깥쪽으로 넣어줄 용액입니다.
 
143mM(밀리몰) NaCl(엔에이씨엘), 5.4mM(밀리몰) KCl(케이씨엘), 5.0mM(밀리몰) HEPES(에이치 이 피 에스), 0.33mM(밀리몰) NaH2PO4(엔에이 에이치투 피오 퍼) 0.5mM(밀리몰) MgCl2(엠 지 씨엘 투)의 조성의 10배 농도로 Normal Tyrode stock solution을 만들어 냉장 보관합니다.
 
10배의Normal Tyrode Stock 용액을 10분의 1로 희석하여 Normal Tyrode solution을 만듭니다. 이때 glucose(글루코스) 와 1M(몰) CaCl2(씨에이 씨엘 투)는 나중에 넣고 pH는 NaOH(엔 에이 오에이치)로 적정 7.4를 만듭니다.
 
시험물질과 양성대조물질은 원하는 농도로Normal Tyrode solution에 녹여서 준비해 놓습니다.
 
Internal solution은 미리 만들어서1ml(밀리리터)씩 소분을 해 놓고 deep freezer(딥프리저)에 냉동 보관시켜서 필요 시에 하나씩 꺼내어 녹여 사용합니다.
 
3. 실험과정
Internal solution을 냉동실에서 꺼내 녹인 후 주사기로 빨아 당겨 충진 시킵니다.
 
Capillary glass (카필러리 글레스)를 electrode puller(일렉트로드 퓰러)에 넣고 2단계로 가열하여 얇은 유리관(electrode)를 만듭니다.
실험에 사용되는 기기로는chamber system(챔버시스템)과 headstage(헤드스테이지)의 circuit(서킷)형성. 앰프, A/D converter, computer, recording (Nortocord-hem), macro(마크로)와 micro manipulator(마이크로 메니퓨레이터), 온도 조절장치 등이 있습니다.
 
Normal Tyrode solution은 비커에 담아 챔버에 흘러갈 수 있게 준비해 놓고regulator(레규레이터)를 잠궈놓습니다. 양성대조물질 및 시험물질도 같이 위치시켜 놓습니다.
 
처음에 준비해 놓은 세포를 뽑아서 챔버에 넣고 세포를 20-30분 동안 가라앉힙니다.
가라앉으면 잠가놓은regulator(레귤레이터)를 열어서 Normal Tyrode solution을 흘려줍니다.
 
온도가37±1℃에 맞는지 온도계로 확인하고 맞지 않을 경우 온도조절장치를 이용하여 온도를 맞춥니다.
 
주사기의internal solution을 유리관에 조심스럽게 채우고 툭툭 두드려 유리관안에 있는 bubble을 없애줍니다. Internal solution으로 충진된 유리관을electrode holder에 끼웁니다.
 
이제 컴퓨터에 있는pClamp(피 클렘프)프로그램 열어 seal test라는 창을 실행시킵니다. 그래프의 모양이 일자를 유지하는 것을 확인할 수 있습니다.
 
앰프의offset을 조정해서 0점에 baseline이 오게 합니다.
 
적당한 세포를 골라 현미경 초점의 중심에 둡니다. 그리고 manipulator(메니퓨레이터)를 이용하여 유리관을 cell (셀) 가까이 접근시켜 cell attach(셀 어테치)상태를 만듭니다. Attach(어테치) 상태가 좋을수록 요철모양의 그래프가 점점 처음의 일자형의 그래프로 바뀌는 것을 확인할 수 있습니다.
 
그리고Electrode holder에 부착이 되어있는 주사기를 빨아들여 giga-seal(기가씰)이 되면 앰프의 holding potential을 -80mV(밀리볼트)로 설정한 후 음압 가하여 whole-cell(홀 셀) 만듭니다. 일자의 그래프의 모양에 위아래로 뾰족하게 귀가 생기는 것을 확인할 수 있습니다.
 
전류는 그림과 같이 측정되며 화살표 부분의peak tail current(피크 테일 커런트)의 최고 높은 값을 취합니다. 그리고 시험물질의 농도에 따른 hERG currents의 억제정도를 오른쪽 그림과 같이 그래프로 나타내고, 경우에 따라서는 hERG current의 최대 억제량의 50%를 야기시키는 농도인 IC50(아이씨 휘프티)값을 구합니다.
 
그리고hERG (허그)　전류를 생성할 수 있는 pulse(펄스)를 주입하기 위하여 프로그램에서 pulse protocol(펄스 프로토콜)을 불러옵니다.
 
그리고pulse(펄스)를 주입하여 전류를 측정합니다. Normal Tyrode solution을 관류시키며 control때의 전류를 기록하다가 시험물질을 관류시키며 전류의 변화를 관찰합니다. 이제 실제로 양성대조물질인 E-4031을 투여해서 변화를 관찰하겠습니다.
 
E-4031은selective한 hERG channel blocker(허그 채널 블로커) 로서 100 nM(나노몰) E-4031이 hERG channel을 완전하게 block(블록)하는 것을 볼 수 있습니다.
 
4. 데이터분석
이렇게 나온 데이터를exel(엑셀)로 불러와 분석할 수 있습니다. control대비 시험약물에 대한 hERG current(허그 커런트)의 크기 비율로 분석을 하며 경우에 따라서는 hERG current의 최대 억제량의 50%를 야기시키는 농도인 IC50(아이씨 휘프티)값을 구합니다.
이것으로hERG assay(허그 에세이)에 대한 교육을 마치겠습니다.
 
감사합니다.

문의사항 - 약리연구과(043-719-5205, 전설희)